文|易霄寒

编辑|易霄寒

前言

随着全球气候变化以及不合理的灌溉，盐渍化土壤面积不断扩大，盐渍化程度不断加剧，严重制约作物的生长，造成经济产量的下降。

而盐胁迫是影响作物生长发育和产量的主要非生物胁迫，培育耐盐作物是抵御盐胁迫的一种可行途径。

小麦是我国重大的粮食作物之一，但在生产过程中，盐胁迫会造成小麦产量和品质的下降，制约着小麦的安全生产。

因此，提高小麦对盐胁迫的适应性，对于小麦的高产稳产至关重大，其中发掘和利用小麦耐盐基因，是改良小麦适应盐胁迫的前提和基础。

而胁迫相关蛋白是一类具有A20/AN1锌指结构域的蛋白，在植物中主要参与逆境胁迫的响应。

本研究通过在拟南芥中，过量表达TaSAP12-D基因，来验证其生物学功能，同时检测部分盐胁迫响应基因的表达，旨在为小麦耐盐性方面的遗传改良，提供理论依据和基因资源。

材料与方法

我们将使用来自中国农业科学院作物科学研究所，景蕊莲课题组的小麦品种旱选10号，进行基因克隆及表达模式分析。

第一挑选籽粒饱满的小麦种子置于培养皿中，加去离子水后置于光照培养箱中水培，温度为23℃，光周期为12h光照/12h黑暗。

在萌发期和幼苗期取样，包括胚芽、叶和根，用于基因的组织表达分析。

待幼苗长至一心一叶期，再进行NaCl处理，先将培养皿中的去离子水倾倒干净，后将250mmol·L-1的NaCl溶液加入培养皿中，并浸没幼苗的根部，分别于加入溶液后0、0.5、1、3、6、9和12h取幼苗的叶片，用于盐胁迫条件下的基因表达分析。

上述样品取样后迅速放入液氮中速冻，贮于-80℃备用。

接着使用拟南芥哥伦比亚0型进行基因的遗传转化，再使用烟草进行基因编码蛋白的亚细胞定位，培养条件为23℃，光周期为16h光照/8h黑暗。

接下来我们将进行目的基因的克隆与序列分析。

根据HMMER软件搜索到的TaSAP12-D参考序列设计，特异性引物TaSAP12-D-F和TaSAP12-D-R，以小麦cDNA为模板，用
TransStartFastPfuDNAPolymerase进行目的基因的克隆。

具体反应条件为：

95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸10min，随后使用在线分析软件ProtParamtool，预测目的基因编码蛋白的分子量及等电点。

将所得的目的基因编码的氨基酸序列，提交到NCBI数据库中进行BLASTP比对，获得其他物种的同源序列，再使用DNAMAN和MEGA6软件，分别进行多重序列比对和同源性分析。

利用重组载体pCAMBIA1300-TaSAP12-D-GFP，在烟草叶片中进行亚细胞定位，再利用引物TaSAP12xD-F和TaSAP12k-D-R，以1.2中克隆的目的基由于模版进行PCR反应，反应条件同1.2。

然后将目的基因引入XbaI和KpnI酶切位点，双酶切后将目的基因（不含终止子）构建到植物表达载体pCAMBIA1300的多克隆位点内，采用热激法，将其转化到GV3101农杆菌中，震荡培养至OD值为1时收集菌体，重悬后注射烟草叶片，培养2d后观察荧光信号。

为揭示目的基因在盐胁迫条件下的作用机制，我们将以拟南芥Actin基由于内参，将正常条件培养10d和盐胁迫处理10d的转基因拟南芥叶片，和对照植株叶片作为试验材料，采用qRT-PCR对盐胁迫相关应答基因AtP5CS1、AtRD29A、AtLEA、AtSOS1、AtNHX1和AtHKT等的表达模式进行分析。

TaSAP12-D的克隆及序列分析

根据HMMER软件，搜索小麦D基因组数据库，得到目的基因的参考序列，设计特异性引物，从小麦品种旱选10号中扩增目的基因。

序列分析表明，该基因序列全长519bp，编码172个氨基酸，命名为TaSAP12-D，其编码的蛋白在N端有1个A20结构域，在C端有1个AN1结构域，属于SAP蛋白最常见的组合类型，预测其蛋白分子量为18.41kDa，等电点为9.21。

将TaSAP12-D的氨基酸序列提交到NCBI数据库中，进行BLASTP比对，获得其他物种的同源序列，再利用DNAMAN进行多重序列比对。

结果显示，TaSAP12-D与其他植物中的A20结构域和AN1结构域的氨基酸序列高度类似。

利用MEGA6进行同源性分析，TaSAP12-D可与其他单子叶植物的SAP划分为一类，包括大麦、谷子、水稻和高粱，其他双子叶植物的SAP划分为另一类。

为了解TaSAP12-D在细胞中的表达部位，我们将TaSAP12-D与GFP进行融合。

构建融合表达载体pCAMBIA1300-TaSAP12-D-GFP，将其转入农杆菌中并注射烟草叶片，以空载体pCAMBIA1300-GFP作为对照，在激光共聚焦显微镜下观察荧光信号。

结果表明，TaSAP12-D在细胞核和细胞质中均有表达。

为揭示TaSAP12-D在小麦不同组织的表达模式，分别选取了萌发期的胚芽、根，以及幼苗期的叶、根进行qRT-PCR。

结果显示，TaSAP12-D在萌发期和幼苗期的胚芽、叶、根中均有表达，但在幼苗期的叶中表达量最高，其表达量是幼苗期根部表达量的3.7倍；在萌发期的根部表达量最低，胚芽的表达量是根部的2.4倍。

随后用NaCl对小麦幼苗进行盐胁迫处理，发现TaSAP12-D的表达水平随时间呈现先升高后降低的趋势，在处理1h时达到高峰，约为对照的4.1倍，表明TaSAP12-D参与了高盐胁迫响应。

过表达TaSAP12-D增强拟南芥的耐盐性

对转TaSAP12-D拟南芥进行正常条件培养和盐胁迫处理14d，在MS培养基上野生型、转空载体植株（VC）和转基因拟南芥（L1、L2和L3），均能正常生长，且长势基本一致，说明TaSAP12-D并未对拟南芥的生长产生影响。

在添加150mmol·L-1NaCl的MS培养基上，野生型和转空载体植株的叶片发黄，甚至变白死亡，而转基因拟南芥的叶片仅少部分发黄和变白死亡。

利用qRT-PCR检测T3代转基因拟南芥纯系中TaSAP12-D的表达量，测得3个转基因拟南芥纯系中TaSAP12-D的表达量依次是野生型（WT）的36、50和42倍。

存活率统计显示，野生型和转空载体植株的存活率分别为34.2%和37.5%，两者无显著差异；而3个转基因拟南芥的存活率依次为81.7%、86.7%和83.3%，极显著高于野生型植株，并且与转基因拟南芥中TaSAP12-D的表达量变化趋势一致，说明过表达TaSAP12-D增强了拟南芥的耐盐性。

为揭示TaSAP12-D在盐胁迫条件下的作用机制，我们采用qRT-PCR检测与盐胁迫相关应答基因的表达情况。

结果表明，在盐胁迫下，渗透调节基因，如脯氨酸合成的关键基因、脱水诱导基因、胚胎发育晚期丰富蛋白基因的表达量极显著增高，是WT的3.1~13.3倍。

离子转运基因，如盐超敏感基因、Na+/H+转运蛋白基因、高亲和性钾离子转运蛋白基因的表达量同样显著或极显著增高，是WT的1.5~3.2倍。

由此推测，TaSAP12-D在盐胁迫条件下，可能通过调控上述两类基因的表达，一方面缓解渗透胁迫，另一方面调节离子平衡，从而增强转基因拟南芥的耐盐性。

讨论

为抵御外界不良环境，植物在长期进化过程中，从形态建成以及生理代谢途径等方面形成了一系列复杂的防御机制，以保证其正常的生长和繁衍。

当植物遇到逆境时，外界的胁迫信号会传递到植物体内，从而改变遗传调控网络，启动胁迫相关基因的表达，来缓解胁迫带来的伤害。

本研究从小麦D基因组中，克隆得到胁迫相关蛋白基因TaSAP12-D，其编码的蛋白在N端和C端分别含有1个A20结构域和1个AN1结构域，属于SAP蛋白最常见的组合类型，先前报道的TaSAP1、TaSAP2和TaSAP5也属于此组合类型。

而蛋白质在细胞中的定位，反映了其在细胞中行使功能的部位，TaSAP12-D的亚细胞定位显示，其在细胞核和细胞质中均有分布，这与TaSAP5、TaSAP7-A和TaSAP17-D的亚细胞定位结果相一致。

有文献报道，部分A20/AN1型的SAP蛋白具有E3泛素连接酶功能，因此推测TaSAP12-D可能作为转录因子在细胞核内发挥功能，或者泛素化降解某类蛋白，在细胞质中进行蛋白质翻译后的修饰。

基因的时空表达也与其生物学功能密切相关，已有报道发现，TaSAP17-D的表达水平受盐胁迫诱导。

本研究中，组织表达分析显示，TaSAP12-D在幼苗期的叶中表达量高，因此选择在幼苗期进行盐胁迫处理，对叶片中TaSAP12-D的表达水平进行分析，结果表明其在盐胁迫条件下表

达量同样上调，暗示其在应对盐胁迫中发挥功能。

不仅如此，土壤中过多的盐离子常常会导致植物生长发育缓慢，植株矮小甚至死亡，即盐胁迫是影响植物生长发育的重大环境因素之一。

高浓度的盐离子，一方面影响植物根系对水分的吸收，产生渗透胁迫；另一方面会破坏植物细胞中的离子平衡，产生离子毒害。

在盐渍化的土壤中，作物难以正常生长，利用盐渍化土地资源的有效措施之一，就是挖掘作物中的耐盐基因资源，从而提高作物的耐盐性，培育出耐盐新品种。

而耐盐基因资源一般包括调节基因和功能基因两大类。

调节基因在早期表达，可以通过调控和启动下游的多个代谢途径，来行使生物学功能，因而得到广泛的关注。

本研究将TaSAP12-D基因转入拟南芥中，并未发现该基因对拟南芥的生长产生影响；但在盐胁迫条件下，转基因拟南芥叶片仅少部分发黄和变白死亡，存活率显著高于野生型和转空载体植株。

这说明过表达TaSAP12-D增强了拟南芥的耐盐性。

有研究表明，TaSAP1可以提高拟南芥幼苗的耐盐能力，同时参与逆境调控网络的多个重大胁迫应答基因上调表达。

TaSAP17-D同样可以增强拟南芥的耐盐性，且渗透调节相关基因上调表达，推测其耐盐性的增强与渗透调节能力的提高有关。

本研究中，转TaSAP12-D拟南芥中盐胁迫相关应答基因AtP5CS1、AtRD29A、AtLEA、AtSOS1、AtNHX1和AtHKT的表达量均显著或极显著上调。

推测TaSAP12-D可能通过调控上述两类基因的表达，来调节细胞的渗透势和维持离子平衡，从而提高转基因拟南芥的耐盐性。

结论

本研究从小麦品种旱选10号中克隆得到TaSAP12-D基因，其编码的蛋白在N端和C端分别含有1个A20结构域和1个AN1结构域，亚细胞定位显示其在细胞核和细胞质中均有表达。

TaSAP12-D在小麦萌发期和幼苗期的胚芽、叶、根中均有表达，但在幼苗期的叶中表达量最高，且该基因在盐胁迫条件下表达量上调。

过表达TaSAP12-D增强转基因拟南芥的耐盐性，在转基因拟南芥中盐胁迫相关应答基因AtP5CS1、AtRD29A、AtLEA、AtSOS1、AtNHX1和AtHKT的表达量均显著或极显著上调。

我们推测TaSAP12-D，可能通过调控上述基因的表达，来增强转基因拟南芥的耐盐性。

综上所述，TaSAP12-D在应答盐胁迫的遗传调控网络中，具有比较重大的作用，是改良作物耐盐性的重大候选基因。